产品货号:
ZN1524
中文名称:
通用型原位杂交检测试剂盒III(碱性磷酸酶)
英文名称:
ISH Detection Kit III(AP)
产品规格:
100T
发货周期:
1~3天
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本制品是专门设计的敏感性加强型原位杂交检测试剂盒。具有敏感性特高,操作简便和结果准确的优点。该试剂盒分为两种,一种为过氧化物酶检测,一种为碱性磷酸酶检测系统。用于mRNA的杂交。本试剂盒仅适于地高辛高效标记的寡核苷酸探针,不推荐使用每个探针分子仅标记一个地高辛的寡核苷酸探针。如果使用cDNA探针,应在杂交之前变性探针。
所谓原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法,在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。现在原位杂交已成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生,发展和调控等根本性问题的有力工具,其作用是免疫组化所无法代替的。
组分 | 规格 | 说明 |
胃蛋白酶 | 1mL | 用蛋白酶稀释液按照1:10比例稀释 |
蛋白酶稀释液 | 12mL | 为3%柠檬酸。用于稀释胃蛋白酶 |
预杂交液 | 2mL | 探针杂交前的预杂交。即用型,直接滴加 |
探针稀释液 | 2mL | 用于稀释探针 |
封闭液 | 5mL | 抗体孵育前的封闭。即用型,直接滴加 |
AP标记鼠抗地高辛抗体 | 5mL | 碱性磷酸酶标记的小鼠抗地高辛抗体。浓缩液,需用0.01M TBS稀释200倍 |
20×显色剂A | 0.5mL | BCIP/NBT显色剂A,需稀释20倍 |
20×显色剂B | 0.5mL | BCIP/NBT显色剂B,需稀释20倍 |
中性核固红 | 6mL | 复染,即用型,直接滴加 |
水溶性封片剂 | 6mL | 封片剂,即用型,直接滴加封片 |
保存:2~8℃,避免冷冻,有效期1年。
组织固定液(含DEPC)、2×SSC、0.5M PBS、10mM TBS、Triton X-100(细胞片用)
- 3%柠檬酸:100mL蒸馏水中加3g柠檬酸(C6H8O7·H2O),pH2.0左右。
- 2×SSC:1L蒸馏水中加17.6g NaCl,8.8g柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O)。
- 0.5×SSC:300mL蒸馏水加100mL 2×SSC即可。
- 0.2×SSC:270mL蒸馏水加30mL 2×SSC即可。
- 0.5M PBS:1L蒸馏水加30g NaCl,6g Na2HPO4·12H2O,0.4g NaH2PO4·2H2O,pH7.2~7.6。
- 10mM TBS:1L双蒸水中加入8.5g NaCl,1.2g Tris,pH7.2~7.6。
- 原位杂交实验的样本固定很重要。首先是固定液中需加入0.1%的DEPC,以抑制RNA酶对核酸的分解作用。其次,固定时间建议不要超过6小时(细胞片15分钟即可),过度固定会造成背景加深、阳性减弱、定位不准等不利影响。
- 实验中预杂交和杂交温度较高,需在湿盒中加足量的水以保证样本始终处于湿润状态,切勿干片。
- 如果有少量的细胞核着色属于正常情况;如果出现大量的细胞核着色,往往和标本固定时间过长有关,应重新处理标本。
- 当其它非特异性染色很明显时,可以用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释,一般稀释2~5倍。
- 石蜡片及冰冻片染色步骤:
- 石蜡切片,常规脱蜡至水。冰冻片无需此操作,从第2步开始。
- 暴露mRNA片段:滴加新鲜配制的胃蛋白酶,室温孵育消化2~10分钟。0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
- 胃蛋白酶∶蛋白酶稀释液=1∶10,现配现用。
- 新鲜样本可以考虑不消化,越陈旧的样本消化时间越长。
- 胃蛋白酶∶蛋白酶稀释液=1∶10,现配现用。
- 预杂交:按每张切片20μL加预杂交液。37℃孵育2~4小时。吸取多余液体,不洗。孵育期间一定要保证组织为湿润状态,不得干片(湿盒内加足量的水)
- 杂交:用探针稀释液稀释地高辛标记的寡核苷酸探针(稀释后的杂交液浓度一般为0.5~2μg/mL)。每张切片加20μL稀释好的杂交液,40℃杂交过夜。
- 需保证覆盖组织,若组织过大,可适量增加杂交液的量。
- 若此温度阳性结果不明显,可提高杂交温度至60℃,期间需保证组织不得干片。
- 需保证覆盖组织,若组织过大,可适量增加杂交液的量。
- 杂交后洗涤:
① 2×SSC洗涤5分钟×2次;
② 0.5×SSC洗涤15分钟×1次;
③ 0.2×SSC洗涤15分钟×1次。
④ 必要时可重复0.2×SSC洗涤1次。 - 封闭:滴加封闭液,37℃孵育30min。甩去多余液体,不洗。
- 滴加碱性磷酸酶标记鼠抗地高辛抗体:用10mM TBS按1∶200稀释,37℃孵育60分钟,或室温2小时,10mM TBS洗5~10分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
- 显色:BCIP/NBT显色液A∶显色液B∶蒸馏水按照1∶1∶20比例配制,现配现用,混匀后加至切片。镜下控制反应时间。蒸馏水洗涤。
- 1mL显色液配制方法:1mL蒸馏水+50μL显色液A+50μL显色液B。
- 该显色液显色时间较长,若无背景出现可长时间显色,直至结果满意为止。
- 1mL显色液配制方法:1mL蒸馏水+50μL显色液A+50μL显色液B。
- 核固红轻度复染:水洗,干燥后水溶性封片剂。
- 显微镜观察。
- 石蜡切片,常规脱蜡至水。冰冻片无需此操作,从第2步开始。
- 细胞片的染色步骤:
- 取出细胞爬片,TBS缓冲液浸泡5min。
- 破膜。使用0.25% Triton X-100处理细胞15min,TBS缓冲液洗涤,5min×3次。
- 其余步骤和石蜡切片2~10步相同。
- 取出细胞爬片,TBS缓冲液浸泡5min。
阳性着色为蓝紫色,但要注意区分非特异着色。
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